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摘要：本研究通过采用单因素试验法和正交试验法优化粪肠球菌HEW-AEf507的发酵工艺，提高发酵液中粪肠球菌的活性。 最终获得了粪肠球菌的最佳发酵工艺，为其规模化生产奠定了基础。
关键词：粪肠球菌； 发酵工艺； 正交试验
近年来，抗生素滥用引起了细菌耐药性、超级细菌出现、农畜产品药物残留等问题，人们普遍认为这些直接危害人类健康。 因此，研究绿色、安全的抗生素替代品已成为新型饲料添加剂的发展趋势。 微生态调节剂作为一种新型饲料添加剂，可分泌有机酸、维生素、细菌素、消化酶等物质，改善动物肠道环境，抑制病原菌生长繁殖，维持肠道菌群平衡，提高动物免疫力和生产力[ 1，2 ]。 粪肠球菌是一种广泛使用的乳酸菌类微生态调节剂，已有研究表明，它能降低肠道pH，分泌细菌素等物质维持动物消化道健康，还能分泌营养物质，提高动物生长性能，促进动物健康生长[3]； 提高动物免疫力，改善动物抗病能力[4~6]可直接改善仔猪生长性能，防止腹泻等[ 7，8 ]。
本研究考虑扩大粪肠球菌生产，研究粪肠球菌HEW-AEf507的发酵培养基和发酵条件，以降低生产成本，提高生产质量，便于粪肠球菌的工业化生产。
材料和方法1材料
1.1供试股票
由北京好实沃生物技术有限公司研发中心提供，命名为HEW-AEf507，在MRS培养基中常规培养。
1.2培养基及试剂表1主要培养基及其成分
乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、玉米粉、小麦粉、可溶性淀粉、麸皮、酵母膏、大粉、棉籽粉、磷酸氢二钾、硫酸铜、硫酸锌等试剂均为国产分析试剂。
1.3主要仪器和设备
电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司JA2003型)、恒温振荡培养箱(江苏省太仓市实验设备厂HZC-250型)、立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂LDZH-200KBS型)、高速冷冻离心机(德国KONTRON公司T-42K型) 2试验方法
2.1培养基单因素试验
碳源筛选。
以发酵培养基为基础，以葡萄糖、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖为碳源替代蔗糖，其他成分不变，发酵条件为：液量300mL/1L，接种量2%，摇床转速180r/min 培养结束后，平板计数检测发酵液中活菌数。 以基础发酵培养基为对照，通过比较不同碳源对发酵液活菌数的影响，选出最佳碳源。
氮源筛查。
以筛选出的最佳碳源为碳源，以发酵培养基为基础，以蛋白胨、麸皮、酵母膏、黄豆粉、棉籽粉、玉米膏干粉为氮源进行替代，其他成分不变。 发酵条件为液量300mL/1L、接种量2%、摇床转速180r/min、培养温度37、培养时间12h培养结束后，通过平板计数检测发酵液中活菌数。 以基础发酵培养基为对照，通过比较不同氮源对发酵液活菌数的影响，选出最佳氮源。
无机盐的筛选。
以筛选出的最佳碳氮源为碳氮源，以发酵培养基为基础，磷酸氢二钾、硫酸铜、碳酸钙、硫酸锌、硫酸亚铁为无机盐取代MgSO4，其他成分不变。 发酵条件为：液量300mL/1L、接种量2%、摇床转速180r/min、培养温度37、培养时间12h。 培养结束后，平板计数检测发酵液中活菌数。 以基础发酵培养基为对照，通过比较不同无机盐对发酵液活菌数的影响，选出最佳无机盐。
2.2培养基正交优化试验
通过单因素试验确定基础发酵培养基的碳源、氮源和无机盐，以检测发酵液中活菌数( CFU/mL )为指标，测定a (葡萄糖，g/100mL )、b )乳糖、g/100mL )、c )酵母浆
2.3摇瓶发酵条件优化
通过培养基正交试验确定发酵培养基成分，探索发酵条件：
接种量优化：将种子液按1%、2%、4%、6%、8%、10% (体积比)分别放入发酵培养基中，在不改变其他条件下进行摇床培养，检测各发酵液中活菌数。
初始pH优化：培养基初始pH值分别调整为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0时，接种量为最佳接种量，在其他培养条件不变的情况下，进行摇床培养，检测各发酵液中活菌数。
温度优化：接种量和初始pH为最佳条件，但不改变其他条件，发酵液分别放入20、25、30、35摇床振荡培养，检测各发酵液中活菌数。
发酵时间优化：接种量、初始pH、培养温度均为最佳条件，其他培养条件不变，分别在4h、8h、12h、16h、20h、24h时检测各发酵液中活菌数。
转速优化：接种量、初始pH、培养温度和培养时间均为最佳条件。 在转速分别调节为100r/m、120r/m、150r/m、180r/m、200r/m、240r/m的情况下，进行摇床培养，检测各发酵液中的活菌数。
2结果与分析1培养基优化结果
1.1培养基单因素试验结果
不同碳源对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响如图1所示。 碳源为葡萄糖时，发酵液总活菌数最高为1.0109CFU/mL，而碳源为乳糖时，发酵液活菌数达到9.7108CFU/mL，表明发酵过程中可以选择葡萄糖和乳糖作为混合碳源。 因此，HEW-AEf507发酵培养基以葡萄糖-乳糖复合使用为最佳碳源，比例暂定为1:1。
图1不同碳源对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
不同氮源对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响如图2所示。 氮源为玉米蒸汽干粉时，发酵液活菌数最高为1.17109CFU/mL。 而氮源为酵母膏时，发酵液活菌数可达1.0109CFU/mL。 结合实际需要考虑，发现HEW-AEf507发酵培养基选择酵母膏与玉米蒸汽干粉复合使用为最佳氮源，比例暂时确定为1:2。
图2不同氮源对HEW-AEf507发酵液中活菌数的影响
不同无机盐对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响如图3所示。 无机盐为硫酸亚铁时，发酵液活菌数最高为1.3109CFU/mL，可见HEW-AEf507发酵培养基选择硫酸亚铁作为最佳无机盐。
图无机盐对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
1.2培养基正交试验优化结果
培养基成分优化的正交试验结果如表2所示。 表2中的r值表明，各因子对发酵液活菌数的影响大小依次为AEBDC，表中的k值表明各因子水平的最佳组合A2B2C1D4E3，即葡萄糖1%、乳糖2%、玉米淀粉6%、硫酸亚铁表2 HEW-AEf507培养基优化L16(45 )正交试验结果
2培养基条件优化结果
)接种量对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
接种量的多少对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响如图4所示，随着接种量的增加发酵液活菌数也在增加，接种量为4%时达到最大，然后下降并趋于稳定，因此确定最佳接种量为4%。
图接种量对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
)2)初始pH对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
初始pH对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响如图5所示，初始pH从4增加到7时发酵液活菌数增加，初始pH达到8时开始下降，由此确定最佳初始pH为7.0。
图5初始pH对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
)3)温度对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
温度对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响如图6所示。 随着温度的升高，发酵液中活菌数也增加，温度增加到30时发酵液活菌数最高，然后随着温度的升高，发酵液中活菌数开始下降。 因此，决定最佳温度为30。
图6温度对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
)4)发酵时间对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
HEW-AEf507发酵液的活菌数随发酵时间的变化如图7所示。 随着时间的延长，发酵液活菌数呈增加趋势，增加幅度在第12h最大，为1.55109CFU/mL，之后趋于稳定。 根据发酵液活菌数随发酵时间的变化，确定了HEW-AEf507发酵的最佳时间为12h。
图7 HEW-AEf507发酵活菌数随时间变化情况
)5)转速对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响
转速对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响如图8所示。 可见，转速为200r/m时，发酵液活菌数最高，为1.59109CFU/mL。 因此，最佳转速决定为200r/min。
图8转速对HEW-AEf507发酵液活菌数的影响3发酵工艺优化验证试验结果
采用优化的发酵条件进行验证实验，重复试验3次，测定发酵液中活菌数分别为1.57109CFU/mL； 1.62109CFU/mL； 1.65109CFU/mL，平均含量为1.6109CFU/mL，而空白组活菌数为9.1108CFU/mL，提高了75.82%。 由此验证试验结果高于正交试验各实验组，重复性好，说明该发酵条件是较优的条件。
3粪肠球菌作为一种新选育的菌种，生物特性优良，可在肠道内迅速定植形成优势菌群，通过产酸、粪肠球菌等抑制有害微生物生长[9]，增强机体免疫力[10]，提高饲料转化率，促进营养吸收，提高生长性能，提高肠道菌群粪肠球菌作为饲料添加剂在畜牧生产中大大减少了抗生素的使用，进一步保证了食品的安全性。
本研究对筛选得到的1株优良粪肠球菌进行了发酵工艺优化，通过单因素和正交试验，获得了菌株HEW-AEf507的最佳发酵培养基和最佳发酵条件。 分别为葡萄糖1%、乳糖2%、玉米搅拌器6%、硫酸亚铁0.1%、MnSO4 0.05%、NaCl 0.5%； 4%接种量，初始pH7.0，培养温度30，摇床转速200r/min，培养时间12h。 优化后的HEW-AEf507发酵液活菌数可达1.63109CFU/mL，比优化前提高75.82%，发酵液中菌体的产量大幅增加。 优化发酵培养基成分和发酵条件，不仅可以提高发酵产物的产量，而且节约成本，有利于优良菌种在扩大化生产中的应用。 目前，除单因素试验法和正交试验法外，发酵工艺优化方法还有响应面法、Placket-Burman设计法、均匀设计法和中心组成法等，本研究采用单因素试验法和正交试验法，采用相同方法优化枯草杆菌发酵条件，获得最佳发酵条件通过对发酵工艺的研究，发现不仅可以减少原料浪费，节约成本，而且可以有效地提高生产效率。 目前菌株HEW-AEf507的研究尚处于试验阶段，需进行发酵罐生产试验、动物试验等深入研究，准备制备微生态制剂，为试验大规模生产奠定坚实的基础。
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结束了
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